污水廠再生水中耐氯大腸桿菌篩查及細菌耐藥性分析
為研究再生水回用過程中的生物安全風險，對兩座城鎮污水處理廠再生水樣品中人源微生物污染、耐氯大腸桿菌分布及細菌耐藥性情況進行調查分析。結果顯示，85.7%的再生水樣品存在人源微生物污染風險；再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，占所分離大腸桿菌的20% (8/40)，為我國首次報道該菌存在，該菌的出現對水處理過程中微生物的有效消殺提出了挑戰；50%(20/40)的大腸桿菌至少耐受一種抗生素，10%耐受至少3中抗生素，3株大腸桿菌呈ESBL陽性，說明再生水具有耐藥性細菌傳播風險。因此，污水處理廠應優化處理工藝，提高對耐氯菌的消殺水平，并通過多部門聯合治理以控制耐藥菌傳播，提高再生水的生物安全性。
污水再生回用是緩解水資源短缺的有效途徑，目前再生水已被用于城市景觀、農田灌溉、地下水回灌、工業冷卻水、洗車等。然而再生水中可能含有多種病原微生物（如病毒、細菌、寄生蟲等），因此保障再生水的生物安全性至關重要。
再生水生產工藝包含多種微生物去除手段，其中物理手段包括膜過濾、紫外線，化學手段主要包括加氯消毒及臭氧消毒。氯消毒方式應用較為廣泛，它主要利用次氯酸（HClO）和二氧化氯（ClO2）的氧化特性，破壞微生物體內的蛋白質、DNA和RNA等，達到殺菌效果。Zhi等人的前期研究發現污水中存在高耐氯菌，這類菌株還攜帶耐熱基因，具有很強的耐熱性，同時攜帶特異性DNA標記uspc-IS30-flhDC。這些耐氯菌株的出現將降低氯消毒的殺菌效果，威脅再生水的生物安全性。
再生水中細菌耐藥性問題也是目前關注熱點。污水中含有大量的微生物，為基因水平轉移（HGT）提供了良好環境。通過HGT，抗性基因可傳遞到某些致病菌中，反之毒力基因也可傳遞到抗性菌中，促進了抗性致病菌的出現。研究發現，氯消毒可提高污水所含抗生素基因含量這些都對再生水的微生物安全造成巨大挑戰，若處理不當則可成為耐藥菌傳播的源頭。為此，以寧波市兩家污水處理廠的再生水為例，調查其進水及再生水中是否存在耐氯大腸桿菌，并測定再生水中大腸桿菌的耐藥性，了解細菌耐藥情況。
01 水樣來源及處理工藝
選取寧波市兩座污水處理廠(A廠和B廠)，采集進水及再生水水樣。兩廠進水主要為生活污水，A廠采用高效沉淀池+濾布濾池工藝，經紫外消毒后回用，B廠采用MBR+D型濾池工藝，經紫外消毒后回用。
02 結果
2.1 再生水廠日常檢測指標
為保障再生水回用安全，我國已出臺相關標準，對再生水用于農田灌溉、景觀環境、工業及城市雜用（如沖廁、消防、車輛沖洗等）作了規定。A、B兩座污水處理廠所產再生水的常規水質指標如表1所示，均達到了《城市污水再生利用 景觀環境用水水質》（GB/T 18921—2019）要求。
由表1可知，兩廠所產再生水中的糞大腸菌群指標遠小于農業灌溉用水、景觀用水、工業用水的限值要求。因此從生物安全性角度，其不僅可用于河道補給，還可拓展應用于農業、工業及景觀用水。然而《城市污水再生利用 城市雜用水水質》中要求大腸桿菌不能檢出，因此目前兩廠所產再生水不能直接用于沖廁、車輛沖洗、城市綠化、道路清掃、消防、建筑施工等城市雜用。
2.2 進出水人源微生物污染檢出率
經測定，所有進水樣品均檢出人源微生物污染HF183分子標記，即檢出率為100%。14個再生水樣品中共有12個檢出人源微生物污染HF183分子標記，即檢出率為85.7%，其中A廠檢出率為100%，B廠檢出率為71.4%，表明兩廠再生水中存在人源微生物污染可能性。
2.3 再生水廠進出水耐氯菌的檢出率
14個污水處理廠進水水樣共有7份樣品檢出耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標記，檢出率為50%，其中A廠檢出率為42.9%（3/7），B廠檢出率為57.1%（4/7）。14份再生水樣品中共有2份檢測出含有耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標記，檢出率為14.3%，其中A廠和B廠的檢出率均為14.3%。
A廠7份再生水樣品中僅有3份樣品有菌落生長，但菌落特征顯示全部為非糞大腸菌群菌落。B廠7份樣品全部長出糞大腸菌群菌落，通過分離鑒定共獲得40株大腸桿菌，其中耐氯大腸桿菌8株。耐氯菌株來自6份再生水樣品，因此再生水耐氯大腸桿菌總檢出率為42.9%（6/14），6份樣品全部來自B廠，B廠的耐氯大腸桿菌總檢出率為85.7%（6/7）。該結果表明， A廠所產再生水具有較高的生物安全性。然而在采樣期間B廠加氯設備未運行，僅使用紫外一種消毒方式，工藝流程的差異可能導致了A廠所產再生水水質優于B廠，未能從A廠再生水樣品中分離到大腸桿菌。
兩廠14份再生水樣品DNA中僅有2份含耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標記，然而，通過對相同14份再生水樣品過濾膜并在MFC培養基選擇性培養糞大腸菌群后，共從6份樣品中分離得到耐氯大腸桿菌。導致出現上述差異的原因可能是在對樣品進行選擇性培養后，大腸桿菌數量大量增加，因此分離得到耐氯大腸桿菌的概率增大。該結果提示可通過對樣品前處理，增加選擇性培養步驟，提高耐氯菌的分離率。
2.4 再生水中大腸桿菌耐藥性
本研究所分離40株大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高為40%，其次為復方磺胺(20%)、環丙沙星(15%)、ESBL(7.5%)、阿莫西林/克拉維酸(7.5%)、頭孢曲松(7.5%)、頭孢西丁(5%)、氨曲南(5%)、左旋氧氟沙星(5%)、慶大霉素(2.5%)、呋喃妥因(2.5%)，見表2。分離得到的大腸桿菌50%至少耐受1種抗生素，5株菌耐受2種抗生素，耐受4種和5種抗生素的菌株各1株，耐受8種抗生素的菌株共2株。40株大腸桿菌中的8株耐氯菌，僅有2株對氨芐西林耐受，1株對復方磺胺耐受，其余5株對所有抗生素敏感。
03 討論
近年來，隨著城市人口劇增和經濟快速發展，全球水資源嚴重不足。與此同時，全球變暖導致的極端氣候頻發愈發加劇了水資源短缺。再生水作為緩解水危機的重要途徑之一，不僅可用于工農業生產及市政雜用，在國外某些缺水地區甚至已嘗試將再生水用作生活飲用水間接補充水源。然而再生水水源含有大量污染物，因此在其回用過程中不僅存在化學性危害風險，其所攜帶的病原微生物對人類的生物安全性風險也不容忽視。
研究發現，在A廠一些再生水樣品中未能檢測到糞大腸菌群，然而這些樣品均含有人源微生物污染標記物HF183，存在攜帶致病微生物風險，說明僅檢測糞大腸菌群不能對再生水安全性進行準確評估。Harwood等人的研究也顯示僅使用個別腸道指示菌（如總大腸菌群、糞大腸菌群、糞腸球菌等）無法準確反映再生水中致病微生物情況。目前我國多項國家標準將檢測糞大腸菌群作為再生水生物安全性評價唯一手段，急需引入其他檢測方法，提高再生水生物安全評估技術水平。隨著測序技術及生物信息學的發展，使用宏基因組技術對樣品中所有微生物進行檢測，在經濟和技術層面的實施性已完全具備。宏基因組技術通過測定樣品中全部核酸序列，可對樣品中所有微生物的種類及豐度進行鑒定。因此可將宏基因組技術應用到再生水回用領域，實現對其生物安全性的全面精確評估。
為保障出水生物安全性，污水處理廠水質凈化過程需包括消毒處理，加入氯消毒劑為最常用消毒手段。目前我國氯消毒劑使用量非常巨大，那么在氯消毒劑的巨量使用所提供的強大進化選擇壓力下，是否會出現耐氯處理致病微生物？大量研究證明，當暴露于有害環境因素后，細菌基因組的高可塑性，使其可進化出抵御機制來保障自身正常生存繁殖，例如細菌的耐抗生素、耐重金屬、耐熱性等特性便可通過基因突變或獲取外源抗性基因獲得。因此大量的氯暴露，必然導致耐氯菌的出現。作者前期研究便發現一些大腸桿菌更適應在污水中生存，這些大腸桿菌對氯的抗性高達標準菌株的100倍，并攜帶一個特異性DNA標記uspC-IS30-flhDC。目前已在加拿大、瑞士、美國污水中發現該類耐氯大腸桿菌。本研究中，B廠7份樣品耐氯大腸桿菌檢出率達85.7%（6/7），說明本地污水系統中存在耐氯大腸桿菌，為首次在我國報道此菌，說明該菌已在全世界范圍流行。該菌株的耐氯性和耐熱性分別為普通菌株的100倍和100萬倍，更易逃過消毒處理，對水處理效率造成挑戰。同時細菌耐氯性與其感染宿主的能力呈正相關，因此該類菌可能更容易突破人體免疫防御系統，危害人類健康，危及再生水生物安全。
本研究并未從A廠分離到耐氯大腸桿菌。A廠使用氯消毒及紫外消毒兩種消毒方式，而B廠在采樣期間僅使用紫外消毒，因此B廠再生水中大腸桿菌含量相對較高，提高了分離到耐氯大腸桿菌的幾率。盡管耐氯大腸桿菌可降低氯消毒效力，本研究顯示A廠所使用的紫外線+氯消毒工藝仍可對其有效去除。多項研究證明，采用聯合消毒工藝，如氯消毒+紫外消毒，可通過彌補各自工藝不足，提高對病毒、細菌芽孢、寄生蟲的殺滅效果。因此為保障再生水生物安全性，建議聯用多種消毒工藝，以提高消毒效果。
污水中含有大量微生物，是細菌耐藥性傳播的重要場所。研究發現，處理后污水排入環境后，可導致下游水體耐藥基因濃度升高。因此再生水回用過程中，需關注其耐藥基因攜帶情況，防止再生水成為耐藥基因傳播媒介。Blaak等人發現污水廠出水中69%大腸桿菌菌株對所測8種抗生素敏感，而Craddock等發現某再生水系統出水中71.4%的菌株對所測24種抗生素敏感。本研究所分離大腸桿菌中50%對所有21種抗生素敏感，但僅有10%菌株耐受3種以上抗生素，因此寧波市再生水中細菌耐藥性問題尚不突出。然而，本研究共分離到3株產ESBL大腸桿菌，ESBL可使菌株耐受多種β-內酰胺類抗生素，包括第三代頭孢菌素和單酰胺環類抗生素，且ESBL菌株常同時耐受其他類抗生素。產ESBL菌株目前在全世界流行性不斷上升，相關部門應當給予高度重視，加強臨床治療及養殖中抗生素使用的監管，控制耐藥菌產生和傳播。同時再生水回用中也需關注此類菌株的存在情況，研究開發新型殺菌技術，降低其通過再生水傳播感染人類風險。
04 結論
寧波兩座污水處理廠所產再生水符合國家再生水回用河道標準，從再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，在我國尚屬首次報道。該菌的出現對水處理過程微生物的有效消殺提出了挑戰，水務部門需優化處理工藝，提高消毒水平。同時，分離到多株耐藥大腸桿菌，其中包含耐ESBL菌株，它們的出現會威脅再生水回用中的生物安全，相關部門應對細菌耐藥性進行聯合治理，從源頭控制耐藥菌的產生，從傳播鏈控制耐藥菌的擴散，保障人類健康。
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